細(xì)胞培養(yǎng)中最重要的是防止細(xì)胞被細(xì)胞以外的微生物污染，如細(xì)菌、真菌、支原體等。實(shí)驗(yàn)室的空氣中、實(shí)驗(yàn)臺(tái)上、實(shí)驗(yàn)人員的手和手指上、口腔中都存在著多種微生物。這些微生物的繁殖速度比細(xì)胞快，可以通過從培養(yǎng)基中竊取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或釋放有毒物質(zhì)來殺死目標(biāo)細(xì)胞。無菌操作是指為防止這些污染物并僅培養(yǎng)所需的生物材料（細(xì)胞等）而進(jìn)行的操作。本文上海通蔚將為您概述了無菌技術(shù)和注意事項(xiàng)！

  培養(yǎng)材料和培養(yǎng)設(shè)備的準(zhǔn)備

  首先，我們準(zhǔn)備材料和設(shè)備，以避免將污染源引入進(jìn)行無菌操作的環(huán)境中。

  所有用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基、試劑、設(shè)備和容器均應(yīng)滅菌。滅菌方法包括使用電烘箱的干熱滅菌、使用高壓蒸汽的高壓滅菌(高壓蒸汽滅菌)以及使用膜過濾器的過濾滅菌。

  玻璃移液器（測(cè)量移液器、駒込移液器、巴斯德移液器）裝在移液器罐中并通過干熱滅菌。此時(shí)，在移液器上放置棉塞可以降低微生物污染率。對(duì)于棉塞，請(qǐng)使用防水的蒲團(tuán)棉代替脫脂棉。微量移液器吸頭裝在特殊的盒子中，用鋁箔包裹，并在高壓滅菌器中滅菌。由于高壓滅菌后芯片上可能會(huì)附著水滴，因此使用前請(qǐng)徹底干燥。

  培養(yǎng)基和試劑滅菌后，進(jìn)行無菌檢查，確保其完全滅菌。對(duì)于培養(yǎng)基，加入少量培養(yǎng)基和血清；對(duì)于試劑，將少量培養(yǎng)基、試劑和血清放入透明管或35 mm培養(yǎng)皿中，并在37°C培養(yǎng)箱中放置約3天。如果存在污染，培養(yǎng)基會(huì)變得混濁，因此應(yīng)將其丟棄并準(zhǔn)備新的。

  如果無法使用上述滅菌方法，可用70%乙醇溶液消毒。將儀器和試劑帶入超凈工作臺(tái)或安全柜時(shí)，應(yīng)先用浸有70%乙醇或奧斯本的紗布擦拭外部后再放入。使用乙醇后，立即使用燃?xì)馊紵鲿r(shí)請(qǐng)小心，因?yàn)樗赡軙?huì)著火。

  實(shí)驗(yàn)者準(zhǔn)備

  實(shí)驗(yàn)者本身可能會(huì)引入微生物，因此在進(jìn)行任何操作之前一定要穿著合適。指甲應(yīng)剪短，長(zhǎng)發(fā)應(yīng)扎起來或塞進(jìn)帽子里。用肥皂徹底清洗雙手和肘部，并用70%乙醇。戴一次性乳膠手套也是一個(gè)好主意，因?yàn)槿绻讣谆蚴种赣邪櫦y而無法充分消毒，或者手或手指有割傷，微生物可能會(huì)殘留。手套還可以有效降低將病原體從標(biāo)本傳播給實(shí)驗(yàn)人員的風(fēng)險(xiǎn)。

  潔凈工作臺(tái)和安全柜

  無菌操作在潔凈工作臺(tái)或安全柜（II級(jí)或III級(jí)）等無菌環(huán)境中進(jìn)行。兩種類型都將空氣通過稱為HEPA過濾器的高性能過濾器輸送到設(shè)備中，從而可以在保持設(shè)備內(nèi)部無菌的同時(shí)完成工作，但由于它們的機(jī)制和功能不同，因此根據(jù)目的和材料使用它們用過的。

  潔凈工作臺(tái)在室內(nèi)產(chǎn)生正壓，并保護(hù)樣品免受設(shè)備外部的微生物污染。供氣上有過濾器，但排氣上沒有過濾器，因此內(nèi)部樣品可能會(huì)泄漏，使其不適合處理轉(zhuǎn)基因生物和病原體。潔凈工作臺(tái)足以進(jìn)行一般無菌操作。

  安全柜（II級(jí)或III級(jí)）在供氣和排氣上均配有負(fù)壓和HEPA過濾器。因此，它不僅可以保持冰箱內(nèi)部無菌，還可以防止設(shè)備內(nèi)部的微生物泄漏到空氣中，還可以用來處理重組生物和病原體。

  無菌操作流程

  使用潔凈工作臺(tái)或安全柜時(shí)，使用前0.5～1小時(shí)打開殺菌燈，使用前關(guān)閉。殺菌燈發(fā)出的紫外線具有很強(qiáng)的殺菌作用，但對(duì)人體和細(xì)胞也有危害，所以工作前一定要關(guān)燈，避免直視殺菌燈。稍微打開門，運(yùn)轉(zhuǎn)風(fēng)扇5至10分鐘，用70%乙醇或奧斯本等消毒劑擦拭工作臺(tái)內(nèi)部，然后開始無菌操作。操作時(shí)，門打開高度不超過25厘米。

  如果您攜帶介質(zhì)、試劑或設(shè)備，請(qǐng)先用消毒劑擦拭表面，然后再將其放在工作臺(tái)上。打開培養(yǎng)基瓶或移液罐的蓋子時(shí)，首先用火焰對(duì)蓋子周圍區(qū)域進(jìn)行消毒，因?yàn)槲⑸锟赡軓钠炕蚬薜拈_口處進(jìn)入。

  為防止進(jìn)入工作臺(tái)的微生物和灰塵落入并污染試劑和培養(yǎng)基，請(qǐng)打開煤氣燈或酒精燈以產(chǎn)生向上的氣流。同樣重要的是不要讓試劑瓶、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿打開，并避免將手或儀器放在打開的蓋子上。

  滅菌后，用消毒液將用過的試劑、儀器擦拭干凈，然后帶出室外，用消毒液擦拭室內(nèi)。關(guān)上門，關(guān)掉風(fēng)扇，打開殺菌燈。殺菌燈發(fā)出的紫外線會(huì)降解塑料，因此最好在大約一個(gè)小時(shí)后將其關(guān)閉，而不是繼續(xù)打開。

  污染防治措施

  污染大致可分為三種類型：細(xì)菌和真菌污染、支原體和病毒污染以及與其他細(xì)胞的交叉污染。

  細(xì)菌和真菌引起的污染可以通過肉眼或顯微鏡檢查來確定，因?yàn)榕囵B(yǎng)基會(huì)因pH值的變化而變得渾濁或變色。然而，支原體和病毒引起的污染和交叉污染很難通過肉眼或顯微鏡檢查來區(qū)分，因此很難注意到污染，因此定期進(jìn)行污染檢測(cè)是個(gè)好主意。

  另外，為防止樣本之間的交叉污染（與其他細(xì)胞的污染）和感染，避免同時(shí)將兩種或兩種以上的細(xì)胞帶入實(shí)驗(yàn)臺(tái)，并為每種細(xì)胞準(zhǔn)備一套培養(yǎng)基和試劑。我們開始做吧。

  如果發(fā)現(xiàn)污染，我們將及時(shí)處理，防止感染傳播給他人。

  以上，我們已經(jīng)說明了無菌技術(shù)的概要和注意事項(xiàng)。通過確保滅菌和無菌技術(shù)可以在一定程度上防止污染。請(qǐng)務(wù)必理解每一步的含義并仔細(xì)執(zhí)行操作。