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免疫印跡法的原理和步驟

發(fā)布時(shí)間:2025-02-26     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  Westernblot,又稱免疫印跡法,是由Towbin等人在1979年發(fā)展完善,并由W.NealBurnette1981年命名的常用蛋白質(zhì)分析方法。該技術(shù)可用于定性和半定量分析蛋白質(zhì)。Westernblot主要包括三個(gè)步驟:按大小分離蛋白質(zhì)(通常使用SDS-PAGE),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體支持物(例如硝酸纖維素膜或PVDF膜)上,以及使用抗體(通常是一抗和二抗)標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)以便進(jìn)行可視化。需要注意的是,Westernblot的半定量分析需要謹(jǐn)慎操作并使用合適的內(nèi)參對照。


  WesternBlot的原理


  Westernblot是一種利用抗體特異性檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。首先,蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE按分子量大小分離,然后通過電泳轉(zhuǎn)移到固相支持物(例如NC膜或PVDF膜)上。膜通過疏水作用和靜電作用吸附蛋白質(zhì)。為了防止抗體非特異性結(jié)合,使用封閉液(例如蛋白質(zhì)溶液、脫脂牛奶或BSA)封閉膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)。接下來,將膜與針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗孵育,使一抗特異性結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)上。洗滌去除未結(jié)合的一抗后,再用標(biāo)記的二抗孵育。二抗與一抗結(jié)合,并通過其標(biāo)記物(例如酶或熒光染料)放大信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的可視化和檢測。通過比較條帶的強(qiáng)度,可以對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析。


  WesternBlot步驟


  蛋白質(zhì)印跡法涉及六個(gè)步驟,包括樣品制備、凝膠電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移、阻斷、抗體孵育以及蛋白質(zhì)檢測和可視化。


  1.樣品制備


  蛋白質(zhì)可以從不同的樣品中提取,例如組織或細(xì)胞。由于組織樣品的結(jié)構(gòu)程度較高,因此首先通過機(jī)械裝置(例如均質(zhì)機(jī)或超聲處理)分解組織。通常使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑來防止樣品在低溫下消化。蛋白質(zhì)提取后,檢測蛋白質(zhì)的濃度很重要,這允許測定每個(gè)孔中裝入的蛋白質(zhì)的質(zhì)量。分光光度計(jì)通常用于蛋白質(zhì)濃縮。


  2.凝膠電泳


  最常用的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠(PAG)和裝有十二烷基硫酸鈉(SDS)的緩沖液。Westernblot使用兩種類型的瓊脂糖凝膠:濃縮凝膠用于將所有蛋白質(zhì)濃縮在一個(gè)帶中,分離凝膠可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離。在SDS-PAGE中,施加電壓時(shí),較小的蛋白質(zhì)遷移得更快。PAGE可以根據(jù)由不同濃度的PAG控制的均勻孔徑分離從52,000kDa的蛋白質(zhì)。通常分離凝膠的濃度為5%8%10%12%15%。當(dāng)我們選擇適當(dāng)百分比的分離凝膠時(shí),我們應(yīng)該考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)的大小。已知的蛋白質(zhì)重量越小,就應(yīng)該使用更高百分比的凝膠。

免疫印跡法原理


  3.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移


  通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后,蛋白質(zhì)從凝膠內(nèi)部轉(zhuǎn)移到固體支持膜上,使蛋白質(zhì)可被抗體檢測到。轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的主要方法稱為電印跡,它使用垂直于凝膠表面的電場將蛋白質(zhì)從凝膠中拉出并移入膜中。它可以在半干或濕條件下進(jìn)行,而濕條件通常更可靠,因?yàn)樗惶赡苁鼓z變干。如左圖所示,膜位于凝膠表面和過濾器之間。轉(zhuǎn)移夾層如下形成:纖維墊(海綿)、濾紙、凝膠、膜、濾紙、纖維墊(海綿)。


  4.封閉


  封閉是Westernblot中的一個(gè)重要步驟,可以防止抗體非特異性地結(jié)合到膜上。最常用的典型封閉劑是BSA和脫脂奶粉。當(dāng)膜放入蛋白質(zhì)的稀溶液中時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)附著在膜上所有目標(biāo)蛋白質(zhì)尚未附著的地方。這樣可以減少Westernblot最終產(chǎn)物中的“噪音”,從而得到更清晰的結(jié)果。

免疫印跡法原理


  5.抗體孵育


  阻斷后,將一抗與膜孵育,一抗即可與目標(biāo)蛋白結(jié)合。一抗的選擇取決于要檢測的抗原。用抗體緩沖液沖洗膜有助于減少背景并去除未結(jié)合的抗體。沖洗膜后,將膜暴露于特異性酶標(biāo)記的二抗中。進(jìn)行二抗孵育時(shí),標(biāo)記的二抗可以與已與目標(biāo)蛋白反應(yīng)的一抗結(jié)合。根據(jù)一抗的種類,我們可以選擇合適的二抗。


  6.蛋白質(zhì)檢測和可視化


  底物與結(jié)合到二抗上的酶發(fā)生反應(yīng),生成有色物質(zhì)。它使我們能夠知道目標(biāo)蛋白質(zhì)的密度和位置。通過將蛋白質(zhì)條帶與標(biāo)記進(jìn)行比較,可以得到大小近似值。有幾種檢測系統(tǒng)可用于蛋白質(zhì)可視化,例如比色檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、放射性檢測和熒光檢測。電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)是最常見的檢測方法。


  Westernblot通常用于定性檢測蛋白質(zhì)和翻譯后修飾(例如磷酸化)。除此之外,它還可用于醫(yī)學(xué)診斷,例如HIV檢測或BSE檢測。



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