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告別 PCR 擴增失敗!5個技巧助你成功

發布時間:2025-02-24     發布作者:上海通蔚生物

  聚合酶聯式反應(PCR)是分子生物學實驗室中擴增特定DNA片斷工具。然而,在實際工作中有可能無法獲得擴增,這樣會影響實驗進展及效率。以下是通蔚為大家整理了解決PCR擴增問題的辦法。


  使用陽性對照進行測試


  確保PCR系統正常運行:使用陽性對照檢查PCR系統是否正常至關重要。如果陽性對照失敗,則可能是試劑或熱循環儀存在問題。


  污染


  交叉污染:確保您使用的設備和試劑沒有受到污染。外來的DNA的存在可能會干擾PCR.


  抑制劑污染:部分樣品可能含有PCR抑制劑,鹽或干擾反應試劑。使用適當的純化方法去除這些抑制劑。


  檢查試劑


  Taq聚合酶質量:Taq聚合酶是PCR中關鍵酶之一。如果這些酶失活或降解,它將無法擴增DNA。確保其處于良好的狀態并已妥善保存。


  緩沖液和dNTP:緩沖液和DNTPDNA合成所需的核苷酸)必須具有適當的濃度。如果存儲不當或受到污染,則影響擴增。


  調整熱循環儀條件


  溫度循環:如果變性、退火和延伸溫度未得到充分優化,則可能無法進行擴增。確保合適的溫度適合你的實驗條件非常重要的。


  循環次數:PCR循環次數不足會阻礙擴增,尤其是在DNA濃度較低的情況下,嘗試增加循環次數。


  檢查引物


  引物設計:如果引物設計不當,他們可能無法與目標序列結合。檢查引物特異性和與要擴增的DNA序列的互補性。


  交叉條件:退火的溫度對于引物結合至關重要。如果溫度過高或過低,引物將無法正確結合。檢查引物的最佳條件。


  驗證DNA質量和濃度


  DNA降解:如果樣本中含有降解的DNAPCR將無法正常工作。確保DNA完整無損且無污染。在凝膠上進行DNA電泳或測量吸光度260/280通常會有所幫助。


  DNA濃度:DNA濃度過低會阻礙擴增。使用分光光度計或定量方法確保DNA濃度正確。


  上述是排查PCR無法擴增的幾種辦法,了解這些辦法,不管現在還是未來有助于提高PCR實驗的進展和效率。希望上述內容對您有個指導作用,如果還有什么疑問,歡迎前來咨詢了解。

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