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  • 小鼠Flag標簽(Flag-tag)ELISA試劑盒

    規格:
    價格:
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW7409
    • 應用 : 僅限于科研使用
    • 英文名 :Mouse Flag-tag ELISA KIT
    • 貨期 : 現貨
    • 靈敏度 :0.06ng/mL
    • 規格 :48T/96T
    • 檢測范圍 :0.125 ~ 8ng/ml
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簡介
FLAG標簽,或FLAG八肽,或FLAG表位,是一種多肽蛋白質標簽,可以用重組DNA技術添加到蛋白質中,其序列圖案為DYKDDDDK(其中D=天冬氨酸,Y=酪氨酸,K=賴氨酸),它是最特異的標簽之一,是一種通用種屬工抗原,已經開發出特異的、高親和力的單克隆抗體,因此可用于親和層析法的蛋白質純化,也可用于定位活細胞內的蛋白質,它已被用于分離重組的、過量表達的蛋白和宿主生物體表達的野生型蛋白,它還可用于分離具有多個亞單位的蛋白質復合物,因為其溫和的純化過程往往不會破壞這種復合物,它已被用于獲得足夠純度和質量的蛋白質,以通過X射線晶體學進行三維結構測定,FLAG標簽可用于許多需要抗體識別的不同檢測中,如果沒有針對某一特定蛋白的抗體,在蛋白上添加FLAG標記,就可以用針對FLAG序列的抗體來研究該蛋白,例如通過免疫熒光、免疫沉淀或通過SDS PAGE蛋白電泳和Western印跡檢測進行細胞定位研究,從N端到C端的FLAG標簽的肽序列是,DYKDDDDK(1012Da),此外,它還可以串聯使用,常見的是3xFLAG肽,DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK(最后一個標簽編碼一個腸激酶裂解位點),它可以與蛋白質的C端或N端融合,或插入到蛋白質內,一些市售的抗體(如 M1/4E11)只有在N端出現時才能識別該表位,然而,其他可用的抗體(如M2)則對位置不敏感,FLAG標簽中的酪氨酸殘基可以被硫酸化,這可能會影響抗體對FLAG表位的識別,FLAG標簽可以與其他親和力標簽一起使用,例如多組氨酸標簽(His標簽)、HA標簽或myc標簽。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術:將捕獲抗體包被于酶標板上,捕獲樣品及標準品中的待測物Flag-tag,清洗后,再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗,形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物,隨后加入鏈霉親和素偶聯的辣根過氧化物酶進行孵育,待孵育結束后清洗,接著加入TMB顯色后,若樣本中有待測物則顯藍色,加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去,用酶標儀在450 nm處測OD值,顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比,通過繪制標準曲線計算出樣本中Flag-tag的濃度。
需要的其他材料
1.  酶標儀,包含450nm測定波長,同時包含600-680nm校正波長更佳;
2.  移液器及槍頭;
3.  蒸餾水或去離子水;
4.  100-1000 mL刻度量筒;
5.  洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機;
6.  水平軌道微孔板振蕩器,能夠保持500±50 rpm的速度;
7.  用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內檢測),或-80℃(6個月內檢測),避免反復凍融,標本溶血會影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液(20×)有晶體析出,需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋(例如:1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水)
標準品配置

試劑盒中取出標準品,準備7個試管,先從160ng/mL標準品(200μL)按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至8ng/mL(例:50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液,制備得到1000μL的8ng/mL濃度標準品),隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液,在這6個單獨的試管中將8ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度,共配制7個濃度的標準品,依次為: 8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL,從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中,輕輕吹打混勻,以此類推進行標準品的倍比稀釋(如圖所示),1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。

小鼠(Flag-tag) ELISA試劑盒

抗體工作液配置
使用前10分鐘,將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘,隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液,根據所需用量當日配置當日使用。
酶結合物工作液配置
使用前10分鐘,將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘,隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液,根據所需用量配置。
備 注:如待測樣本中Flag-tag濃度高于標準品最高值,請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數。
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數邏輯(4-P)曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
示例數據

以下數據和曲線僅供參考,實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。

標準品濃度(ng/mL)

8

4

2

1

0.5

0.25

0.125

0

OD值

2.553

1.616

1.08

0.653

0.385

0.269

0.189

0.061

校正OD值

2.492

1.555

1.019

0.592

0.324

0.208

0.128

0








下圖所示標準曲線僅供示例,結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果

小鼠(Flag-tag) ELISA試劑盒

重復性
板內變異系數小于10%,板間變異系數小于10%。
靈敏度
經樣本測試,本試劑盒的檢測靈敏度為0.06ng/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組小鼠Flag-tag。
其他相關蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL,并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。
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