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產(chǎn)品及特點(diǎn)：
乙型肝炎病毒（HBV）共價閉合環(huán)狀 DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因組 RNA 復(fù)制的原始模板，雖含量較少，每個肝細(xì)胞內(nèi)只有約 5-50 個拷貝，但對乙肝病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義，只有清除了 cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)。因此 cccDNA 的檢測具有重要的臨床意義。
本產(chǎn)品是基于常規(guī) PCR 技術(shù)的乙肝病毒 cccDNA 快速檢測試劑盒。它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供DNA模板。
2. 引物經(jīng)過精心優(yōu)化，專一性強(qiáng)，只擴(kuò)增乙型肝炎病毒cccDNA ，與其他病原沒有交叉反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. PCR mix 中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。
5. 本試劑盒足夠做40μL體系的PCR 50次，但只能用于科研。
規(guī)格及成分：
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編號 |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
PCR MagicMix 3.0 |
1 mL（紅蓋） |
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試劑二 |
超純水 |
1 mL（亮黃色） |
|
試劑三 |
乙型肝炎病毒cccDNA PCR 引物混合液 |
100 μL（白蓋） |
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試劑四 |
乙型肝炎病毒cccDNA PCR 陽性對照（1×10E8 /μL） |
50 μL（黃蓋） |
|
試劑五 |
使用手冊 |
1 份 |
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨(dú)放置，不要污染其他試劑。
自備試劑：
樣品DNA。
使用方法：
一、樣品 DNA 的制備：
1. 用自選方法純化N+2個樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。可以選用本公司柱式病毒 DNAout。
2. 如果有N個樣品，則需要做N+2個提取，包括一個樣品制備陽性對照和一個樣品制備陰性對照。樣品制備陽性對照是在適量水（取決于試劑盒要求的樣品起始量）中加 10μL 乙型肝炎病毒cccDNA PCR 陽性對照的 1000 倍稀釋液而得，樣品制備陰性對照是直接用水。提取結(jié)束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、設(shè)置 PCR 反應(yīng)(40μL 體系)：
3. 對N+2個樣品，在PCR時需要增加一個PCR陽性對照和一個PCR陰性對照，故需要設(shè)置N+4個反應(yīng)。在N+4個PCR管中分別加入下列成分：
|
成份 |
N+2 個樣品管 |
PCR 陰性對照 |
PCR陽性對照 |
|
PCR Magic Mix 3.0 |
各 20μL |
20μL |
20μL |
|
乙型肝炎病毒cccDNAPCR 引物混合液 |
各2μL |
2μL |
2μL |
|
N+2個樣品DNA模板 |
各18μL |
-- |
-- |
|
PCR 陰性對照（水） |
-- |
18μL |
-- |
|
PCR 陽性對照（乙型肝炎病毒cccDNAPCR陽性對照1000倍稀釋液） |
-- |
-- |
18μL |
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過程 |
溫度 |
時間 |
|
預(yù)變性 |
95℃ |
5 min |
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PCR 反應(yīng)35個循環(huán) |
95℃ |
30 sec |
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55℃ |
30 sec |
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72℃ |
40 sec |
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最后延伸 |
72℃ |
7 min |
5. 取 10-20 μL PCR 產(chǎn)物。電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。本產(chǎn)品提供的 PCR Mix 在 擴(kuò)增結(jié)束后可以直接上樣，不需要另外再加 loading buffer。PCR 產(chǎn)物陽 性對照必須有 551bp 大小的條帶出現(xiàn)，陰性對照必須無任何擴(kuò)增，否則實(shí) 驗無效。對沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品，可以稀釋 10 倍后重復(fù) PCR 擴(kuò)增以排除 PCR 抑制劑的感染。
四、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
